华东理工团队利用解脂耶氏酵母高产虎杖苷达6.88g/L，系迄今微生物宿主中的最高滴度

虎杖苷（polydatin）是植物虎杖（Polygonum cuspidatum）的提取物，具有多种生物活性，包括抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗微生物、神经保护、心脏保护和免疫调节作用。

【资料图】

它是白藜芦醇的糖基化衍生物，通过用葡萄糖苷取代白藜芦醇的 C-3 羟基得来，具有比白藜芦醇更高的水溶性、稳定性和抗氧化能力；可以通过葡萄糖转运体进入细胞，并且很容易被吸收。正因为这些特点，它比白藜芦醇具有更好的防癌和治疗效果，生物利用度也更高。

迄今为止，获得虎杖苷的主要途径是从植物虎杖中提取。然而，植物提取物面临着成本高、提取效率低、植物资源可利用性有限等问题。因此，生物合成是生产虎杖苷的一个有吸引力的选择。

近日，华东理工团队在Bioresource Technology杂志上发表文章”Metabolic engineering for the high-yield production of polydatin in Yarrowia lipolytica”，研究以解脂耶氏酵母为生产宿主，葡萄糖为碳源，通过增加前体的供应、改变碳代谢、消除产品降解途径以及优化培养基中的葡萄糖浓度的组合策略，获得虎杖苷的产量达 6.88g/L。这是第一个在解脂耶氏酵母中以葡萄糖为原料生产虎杖苷的例子，也是目前报道的微生物宿主生产虎杖苷的最高滴度。

（来源：Bioresource Technology）

迄今为止微生物宿主生产虎杖苷的最高滴度

在 2021 年的一项研究中，研究人员发现白藜芦醇 3-O-糖基转移酶（3-O-glycosyltransferase，R3GAT）可将白藜芦醇转化为虎杖苷。他们在酿酒酵母中表达 R3GAT，由葡萄糖合成虎杖苷。通过代谢工程和发酵优化，最终得到了虎杖苷的产量为 545 mg/L。

可以看到，他们虽然成功地合成了虎杖苷，但其收率和合成效率仍然较低。

在这一研究基础上，叶邦策等人认为有必要选择合适的底盘菌株，探索虎杖苷合成的瓶颈，并通过修改底盘细胞中碳源所涉及的代谢途径，进一步提高虎杖苷的合成效率。

于是，他们选择解脂耶氏酵母作为底盘菌株。解脂耶氏酵母是典型的产油酵母，这与其丰富的乙酰辅酶 A 前体通量密切相关，也正是本研究所需要的；另外，为了提高糖苷的产量，增加初始培养基的葡萄糖浓度是一种有效的策略，与酿酒酵母不同，解脂耶氏酵母不会表现出克勒勃屈利效应。

克勒勃屈利效应（英文：Crabtree effect）， 1929 年因克勒勃屈利在高浓度的葡萄糖培养基和有氧条件下培养细胞时发现细胞生长受到抑制且生成乙醇的现象而得名。此效应也称葡萄糖效应，主要是细胞对葡萄糖的摄取的生物能转换受到了限制。

▲图丨图形概要（来源：Bioresource Technology）

在这项研究中，首先，在解脂耶氏酵母中建立白藜芦醇的合成途径。具体来说，以 L -酪氨酸（L-Tyr）为前体，然后，L-Tyr 通过酪氨酸解氨酶 （tyrosine ammonia lyase，TAL）、4-香豆酰辅酶 A 合成酶（4-coumaryl-CoA ligase，4CL）和白藜芦醇合成酶（resveratrol synthase ，ST1）催化生成白藜芦醇。虎杖苷的生物合成主要在于白藜芦醇的准确糖基化。

最初，白藜芦醇的产量为 100.8 mg/L。

为了进一步提高白藜芦醇的产量，研究人员增加莽草酸途径通量和直接碳流向白藜芦醇的合成，这是因为，从葡萄糖合成产品需要尽可能地将碳通量导向产品的合成途径。

通过筛选和过表达来自大肠杆菌的反馈抗性的AroG*和TyrA *，成功地增加了莽草酸途径通量。改造后的菌株可产生 146.26 mg/L 的白藜芦醇和 315.16 mg/L 的对香豆酸。

然后，研究人员采取的措施是向前体重新分配碳，增加白藜芦醇的产量。通过进一步对异源合成途径的限速步骤进行测试，发现通过在原始菌株中添加两个 ST1 基因拷贝，白藜芦醇产量提高了 174%。这一结果证实 ST1 的过量表达可以有效地将合成途径转向白藜芦醇的合成；PHK 途径的合理引入增强了乙酰 CoA 的供应，使白藜芦醇产量达到 487.77 mg/L。

在此基础上，将 R3GAT 引入该工程解脂耶氏酵母菌中，从而完成虎杖苷的生物合成。

然而，在合成虎杖苷时，在发酵后期观察到了虎杖苷的降解和白藜芦醇的积累。降解现象可能源于解脂耶氏酵母中存在的葡萄糖苷酶。

因此，敲除四个糖苷酶编码基因以抑制虎杖苷的水解。经筛选，确定同时敲除 EXG1 和 BGL2 有效抑制虎杖苷的降解。最后，由于虎杖苷是一种糖苷类化合物，以葡萄糖为碳源和糖基配体，因此需要优化葡萄糖浓度以进一步提高其收率。在 YPD（100 g/L）培养基中发酵 144 h 后，虎杖苷的产量为 6.88 g/L。

这是迄今为止在微生物宿主中产生的最高滴度的虎杖苷。

解脂耶氏酵母在苷类物质合成方面潜力大

总的来说，本研究成功地建立了第一个在解脂耶氏酵母中以葡萄糖为原料生产虎杖苷的例子，这是文献中报道的最高水平。

在讨论部分，研究人员重点强调了以下内容：

1、外源基因AroG*和TyrA*的过表达有效地促进了 p-CA 和白藜芦醇的产生，并为莽草酸途径的其他下游产物提供了有用的修饰靶点。

2、PHK 途径的引入增强了乙酰 CoA 的供应，这也可以有效地增加脂质的合成，为增加乙酰辅酶 A 衍生的脂类的生产提供了思路。

3、在合成糖苷化合物的过程中，葡萄糖既是生长的碳源，又是产品合成的必要底物。细胞代谢生长和产品合成之间存在着竞争关系。尽可能地将碳源引向产品合成需要进一步探索。通过更系统的代谢工程修改，可以进一步提高虎杖苷的产量。

4、这项研究表明，解脂耶氏酵母在苷类物质合成方面有很大的潜力。该研究还为合成类似的糖类和其他有价值的植物次级代谢物提供了一种代谢工程转化策略。

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